四眼斑龟幼体时(个体重250克以下),因性未成熟,性别难以鉴定。一般个体重达300克以上,性已成熟。雄性的头顶部呈深橄榄绿色,眼部为淡橄榄绿色,中央有一黑点,每一对眼斑的周围有一白环包围,每一对眼斑的周围有1白条纹包围,颈的背部有3条黄色粗纵条纹,颈腹部有数条黄色纵纹,颈基部条纹呈橘红色,前肢及颈腹部有橘红色斑点;雌性的头顶部呈棕色,眼斑为黄色,中央有一黑点,每一对眼斑均前小后大,且周围有灰色暗环包围,颈背部的3条粗纵条纹和颈腹部的数条纹均为黄色,在繁殖期,龟体散发出异样臭味。
四眼斑龟一般在5月初有雄龟追逐雌龟的现象,雄龟绕雌龟打转或在雌龟前面,头对着雌龟,伸长头颈,上下点动或左右摇动,不让雌龟爬动,若雌龟调转头,雄龟则紧追并绕到雌龟的前方。待雌龟不动时,雄龟再绕到雌龟的后面,爬到雌龟的背上,用前肢勾住雌龟的背甲前缘,伸直尾巴将紫黑色的交接器插入雌龟的泄殖腔内。交配后,雄龟从雌龟身上滑下。四眼斑龟交配多在水的中部或岸边进行。产卵期在5-6月中旬。每次1-2枚并有分批产卵的现象。卵长43mm宽22mm重15克左右。